液相色谱与离子色谱中的梯度淋洗

1 等度淋洗与梯度淋洗

进行高效液相色谱与离子色谱分析时，常用两种洗脱方式，即等度淋洗与梯度淋洗。其中等度淋洗在分析全过程中流动相的组成不变。而梯度淋洗中流动相组成随运行过程是变化的（例如氢氧根体系中氢氧化钾浓度由15mM增至50mM）。

下图为几种不同的梯度形状。其中曲线梯度较为不常见。

目前许多实验室对梯度淋洗有很大偏见。他们偏爱等度淋洗的原因有以下几点：

①一些实验室尚不具备支持梯度淋洗的色谱仪（只有一个泵且没比例阀）。

②梯度淋洗更复杂，似乎更难建立新方法。

③某些HPLC检测器(如示差折光检测器)不能使用梯度淋洗。

④每次运行梯度淋洗后需重新平衡色谱柱，耗时较长。

⑤不同设备的分离结果可能不同，所以梯度淋洗法移植时会出现保留时间差异。

⑥梯度淋洗中的基线噪声和基线漂移更大，更容易受到试剂纯度的影响。

⑦某些色谱柱或流动相不适于梯度淋洗。

实际上，梯度淋洗分离方法的建立和日常操作与等度淋洗相比并不太难。而且很多分离只适于使用梯度淋洗。

2 梯度淋洗的优势

用等度淋洗时，由于流动相全程保持不变，如果待分析物，的保留差异很大，则会出现弱保留组分扎堆洗脱且强保留组分很晚才洗脱，从而无法获得满意的分离。

为了比较等度淋洗与梯度淋洗的不同，我们使用同一根色谱柱分离相同的样品，下图是等度淋洗与梯度淋洗的对比谱图，上半部分为等度淋洗曲线，下半部分为梯度淋洗曲线。通过对比我们可以发现，等度淋洗时1~6号峰分离度不太理想，13号峰保留时间过长，而在梯度淋洗时，为了改善1~6号峰的分离，我们采用较低的淋洗液浓度，为了快速洗脱强保留的13号峰，我们在6号峰后提高了淋洗液浓度，使得13号峰由原来的80分钟提前到40分钟。由此可见，梯度淋洗可有效改善弱保留组份分离度，快速洗脱强保留组份。此外，等度淋洗时，弱保留组份峰形比较窄而强保留组份峰形较宽，梯度淋洗时增强洗脱能力可以使强保留组份也获得尖锐的峰形。

3 使用梯度淋洗时的注意点

3.1 基线漂移

在HPLC中，不同流动相（水、甲醇、乙腈）对于紫外吸收的程度不同，导致梯度淋洗时产生基线漂移，且不可避免。

在碳酸盐体系离子色谱中，抑制产物是碳酸，碳酸浓度不同其电导也不同。故梯度淋洗会产生基线漂移，且不可避免。

对于氢氧根淋洗液和甲烷磺酸淋洗液，抑制产物是水，理论上在梯度淋洗时不会产生基线漂移；而实际上由于试剂纯度以及抑制不完全等原因，也是存在基线漂移的。

3.2 流动相平衡

每次梯度淋洗结束时，流动相的组成已经与分析开始时大不相同了。为了下一次的梯度淋洗，必须用初始浓度的流动相对色谱柱进行彻底平衡后，再进行梯度淋洗。

色谱柱平衡时间不足时，色谱图早期被洗脱的峰的保留时间会发生改变，而后期被洗脱的峰通常不受影响。

3.3 流动相浓度的滞后现象

当确定了梯度淋洗程序后，开始梯度淋洗，但由于实现梯度淋洗的仪器设备结构或电子控制系统等多种原因，使得我们实际观测到底梯度淋洗向后平移了一段时间，此现象称为梯度系统的滞后时间。

使用相同的梯度淋洗程序，对于同一个样品，在不同的色谱仪上进行梯度淋洗，由于仪器结构、电路控制以及管线长度的差异，表现出的滞后时间往往不同。

4 梯度淋洗的类型

传统上，梯度淋洗分为高压梯度（也叫内梯度）和低压梯度（也叫外梯度）。另外，在离子色谱领域提出淋洗液发生器的概念后，使用淋洗液发生器时也可以进行梯度淋洗。

4.1 高压梯度（内梯度）

高压梯度又称内梯度，采用多个高压泵将不同的流动相增压后送入混合室混合后送入色谱柱。流动相中有几种变化组分就称为几元梯度。二元梯度淋洗需要两台高压输液泵；三元梯度淋洗需要三台高压输液泵；每台高压输液泵的输出量由程序控制，按照设定程序将不同量的溶剂送到混合室混合，产生任意形式的梯度淋洗曲线。高压梯度通常以二元高压梯度最为常见。

下图为二元高压输液系统示意图。

泵A和泵B出来的流动相在混合器里面混合的时候，都是处于高压状态，这时候，流动相对气体溶解度较高，流动相中不容易析出气泡，从而避免导致液相色谱压力波动、流速不准、基线波动等种种问题。

4.2 低压梯度（外梯度）

低压梯度又称外梯度，是在常压下将流动相的不同组分混合后再用高压输液泵送入色谱柱的方法，利用电磁比例阀控制不同溶剂的流量变化，使溶剂按不同比例被输送入到混合室中混合，然后用一台高压输液泵将混合好的流动相输送到色谱柱中。

低压梯度通常以四元低压梯度最为常见。

流动相对气体的溶解度较低，如果流动相中溶解的气体比较多的话，在混合时就可能有小气泡形成，导致压力波动等种种问题。气泡永远是液相色谱的天敌。

下图为四元低压输液系统示意图。

低压梯度一定要配脱气机，先对流动相进行在线脱气，才能用电磁比例阀进行混合，要不然很容易产生气泡。而高压梯度一般情况下可以不用配在线脱气机就能在线混合，运行梯度方法。

高压梯度的优势：

优势1：混合精确性高

从上面的介绍可以看到，两种梯度体系的混合方式完全不同。高压梯度相当直观，通过分别控制两个泵的流速，就能够准确控制两种流动相的比例。比如在1ml/min的流速下，要达到A：B两种流动相70：30的混合比例，那就设置A泵流速0.7ml/min，B泵流速0.3ml/min就可以了。当然这些都是系统和软件自动完成的。只要做到泵流速准确，比例就能准确。

而低压梯度则通过电磁比例阀来控制混合比例，那比例阀又是如何工作的呢？

一般来说，比例阀是通过控制入口通道分别打开时间的长短来控制混合比例的。

举个例子可能更容易理解，仍然是A：B两种流动相70：30的混合比例。为了达到这个效果，B、C、D三个通道都关闭，A通道打开7ms，这时候进入系统的都是A；然后，A、C、D关闭，B通道打开3ms，这时候进入系统的都是B。这样就得到了70/30的流动相的比例。大家能感觉出来，进入系统的流动相其实是一段A、一段B这样的。如果两种流动相比例比较悬殊（比如某组分只占有1%），这种混合方式的误差相对比较大。

优势2：延迟体积小

使用高压梯度时，流动相混合后，经过混合器、压力传感器、阻尼器，放空阀，然后进入进样器。

反观低压梯度，流动相混合后要经过整个泵头(包括主动入口阀、两个泵腔、出口阀、管路等等)，才能到达进样器。

一般来说，我们把流动相从混合开始，最后到达柱头这段体积叫延迟体积。流动相梯度的变化要到色谱柱头，才能够对分离产生影响，所以有一定的延迟。延迟体积越大，梯度的变化到达柱头的时间越长，导致分析时间越长。

我们可以看到，高压梯度先天地决定了其延迟体积远小于低压梯度。这就决定了在色谱分析时间要求很短的梯度方法中，比如各种小粒径的色谱柱的快速分析方法，都采用高压梯度方法。

不同品牌、类型的液相之间的延迟体积差异，是方法转移后出现结果跟以前不一样了的最大的原因之一。

低压梯度的优势：

高压梯度这么多优势，但在实际上，还是低压梯度用得更多一些。

低压梯度的优势是：便宜。

低压梯度只需要一个输液泵就能运行梯度条件，，高压梯度最低需要两个泵才能运行梯度。在运行方法条件不是很苛刻的时候，低压梯度能达到跟高压梯度一样的分析效果，而价格可能要便宜得多。而且只有一个泵，后期保养成本也低。

因为便宜，所以市场保有量更大，很多标准方法都是在低压梯度下开发的。用高压梯度需要进行方法移植。

如果用一些三元甚至更高元梯度的方法，四元低压梯度可以直接拿来用，高压梯度需要购置三个甚至四个泵，成本进一步提高。

四元低压梯度可以在进样程序中直接设置走完序列后冲洗瓶子；而高压梯度要达成这样的方法，需要购置阀控或者更多的泵。

4.3 离子色谱淋洗液发生器产生的梯度淋洗

离子色谱使用的流动相以酸碱盐的水溶液为主，传统的配制方法是称量试剂并溶解定容。淋洗液发生器通过电解在线产生高纯度淋洗液，并支持梯度程序，是离子色谱发展中的重大跨越。

此处以KOH淋洗液发生器为例介绍淋洗液发生器的原理。淋洗液发生器通电时，阳极电解产生氢离子及氧气，氢离子和罐中的氢氧根离子反应生成水，导致罐中钾离子（阳离子）比氢氧根离子（阴离子）数量多。多出来的钾离子在电场及渗析作用的驱动下通过阳离子膜到达氢氧化钾发生室。阴极在氢氧化钾发生室的底部，电解产生氢氧根离子和氢气。

随着超纯水不断流入氢氧化钾发生室，钾离子和氢氧根离子以及氢气随着水流入CR-ATC（主要作用是去除杂质阴离子）和脱气盒，在脱气盒中氢气被去除。所产生的KOH溶液的浓度由施加电流与去离子水的流速决定。根据法拉第电解定律，在恒定流速下，施加电流和所产生的KOH浓度之间呈正比，可通过控制所加的电流得到准确浓度的KOH淋洗液，因此也可以实现梯度淋洗。

操作鼠标即可设置淋洗液的浓度梯度，有效地简化了操作和缩短了运行时间，使其与等度淋洗一样方便，此项技术被称为“只加水”离子色谱技术。

5 总结

进行梯度淋洗可以达到以下目的：缩短分析周期；提高分离能力；峰型得到改善；增加灵敏度，但通常会引起基线漂移。

在离子色谱中，使用淋洗液发生器产生的梯度淋洗精度通常高于高压及低压梯度，推荐使用。

在液相色谱中，高压梯度及低压梯度各有优势，可根据实验室条件及预算进行选配。

6 参考文献

牟世芬，朱岩，刘克纳.《离子色谱方法及应用》（第三版）化学工业出版社

于世林.《图解高效液相色谱技术与应用》科学出版社

R.施奈德，J.L.格莱吉克 著 王杰 赵岚峰 王树力 丁洁 译 《实用高效液相色谱法的建立》（第二版）科学出版社

青岛睿谱分析仪器有限公司 《离子色谱实用手册》

张新庆 “二元泵和四元泵哪个好”微信公众号